Ймовірно у світі не залишилося людини, котра б не чула про пандемію COVID-19, стикнувшись із нею безпосередньо, тобто перехворівши або начитавшись інформації в мережі інтернет. У зв’язку з цим, з’являється дуже багато хибної інформації, котра часто може заплутати та спричинити неправильні дії особи, що захворіла. Для того щоб внести ясність, у цій публікації буде описано, які тести необхідно робити при інфікуванні коронавірусом і як вони проводяться в сучасних умовах.
Полімеразна ланцюгова реакція зі зворотною транскрипцією в реальному часі
Сьогодні найбільш точним лабораторним методом виявлення коронавірусу і слідкування за перебігом коронавірусної інфекції є полімеразна ланцюгова реакція зі зворотною транскрипцією в реальному часі (ЗТ-ПЛР в реальному часі). Застосування цього методу має на меті виявлення генетичного матеріалу короновірусу у зразку, відібраному з дихальних шляхів пацієнта (мазок з носоглотки, зразок мокротиння тощо), оскільки вірус у першу чергу інфікує клітини слизової оболонки носа.
ПЛР-тести на Covid-19 зі знижкою доступні в медичному центрі “Салютас”. Результати (українською та англійською мовами) — наступного дня. Здати аналіз ви можете з 8 до 16.
Генетичний матеріал коронавірусу – це молекула РНК. Тому спочатку з відібраного зразка виділяють РНК. Виділений на цьому етапі препарат РНК є сумішшю РНК людини і РНК вірусу (якщо вона присутня у зразку). Наступний етап – синтез ДНК-копій РНК за допомогою процесу зворотної транскрипції, який здійснюється за допомогою спеціального ферменту – зворотної транскриптази. Це обов’язковий етап методики, оскільки у ході ПЛР можна розмножити (ампліфікувати) лише молекули ДНК. Якщо у відібраному зразку є геномна РНК коронавірусу, то і в препараті ДНК, отриманому у ході зворотної транскрипції, є ДНК-копії вірусного генома. Далі до отриманої ДНК додають короткі фрагменти ДНК (так звані «праймери»), які специфічно зв’язуються з певними генами вірусу, ферменти і інші реактиви, необхідні для синтезу ДНК, а також флуоресцентні мітки, за допомогою яких оцінюють кількість продуктів ПЛР. У ході ПЛР багатократно повторюється синтез ділянки генома вірусу, до якої приєдналися праймери. Зазвичай проводять більше 40 циклів синтезу ДНК. У кожному циклі кількість копій заданої ділянки вірусного генома зростає вдвічі. У результаті отримують мільярди копій цієї ділянки. Кількість ПЛР-продуктів (тобто копій вірусного гена) вимірюється у кожному циклі ПЛР за допомогою флуоресцентних міток у режимі реального часу. Перевищення отриманого сигналу певного порогового рівня флуоресценції є підтвердженням присутності вірусу (позитивний результат ПЛР).
Сила сигналу говорить про початкову кількість у зразку молекул, які підлягають ампліфікації. Визначають, скільки циклів ПЛР потрібно для того, щоб досягнути цього порогового рівня. Це дає змогу оцінити тяжкість інфекції: чим менше таких циклів, тим вище рівень інфікованості пацієнта, що, відповідно, може свідчити про характер перебігу хвороби. Якщо у зразку немає ДНК-копій вірусного генома, ампліфікація ДНК не проходить, ПЛР-продукти не нагромаджуються (негативний результат ПЛР). Виконання тесту потребує декілька годин.
Існуючі варіанти ПЛР-тестів на виявлення SARS-Cov2 від різних виробників різняться головно тим, який ген коронавірусу є цільовим (тобто ампліфікується) у дослідженні. Найчастіше такими цільовими генами є гени RdRp, ORFlab, N, E, S.аріанти ПЛР-тестів на виявлення SARS-Cov2 від різних виробників різняться головно тим, який ген коронавірусу є цільовим (тобто ампліфікується) у дослідженні. Найчастіше такими цільовими генами є гени RdRp, ORFlab, N, E, S.
Ймовірність виявлення вірусу залежить від методу збору інфіковано матеріалу і того, скільки часу пройшло від моменту зараження.
Зразки отримують у різний спосіб. Це можуть бути мазки з носоглотки, з горла, мокротиння, слина, або матеріал із глибоких дихальних шляхів, зібраний за допомогою відсмоктувального катетера. Наявний досвід свідчить, що тести, проведені із мазками з горла, є надійними лише перший тиждень від моменту зараження. Далі ймовірність виявлення вірусу з використанням таких зразків знижується (89,3%, 66,1%, 32,1%, 5,4% і нуль до шостого тижня). Після першого тижня вірус може залишити горло і розмножуватися в легенях. На другому тижні треба проводити переважно відбір мокроти або матеріалу з глибоких дихальних шляхів. За результатами випробувань середня чутливість для швидких молекулярних тестів становила 95,2% (коливання в діапазоні від 68% до 100%), а середня специфічність – 98,9% (коливання від 92% до 100%) залежно від тестів різних фірм і методів відбору проб. Відповідно ПЛР-набори з високою чутливістю слід рекомендувати для тестування осіб без симптомів хвороби, тоді як набори з нижчою чутливістю достатні для тестування пацієнтів, які мають її симптоми.
Існує принаймні чотири категорії імунологічних методів, які використовують для діагностики антитіл проти SARS-Cov2.
Швидкі діагностичні тести (Rapid diagnostic test, RDT)
Якісні, портативні, швидкі: результат отримують через 10-20 хвилин. У цих тестах можуть використовуватися зразки крові з пальця, зразки слини або рідина з мазка з носа. При діагностиці COVID-19 у цих тестах найчастіше виявляють антитіла пацієнта IgG та IgM до нуклеокапсидного білка N або білка S, або вірусний антиген. Тест ґрунтується на принципах імунохроматографічного аналізу. У тестах використовують спеціальні тест-касети. На смужці в тест-касеті є дві смуги – тестова (розміщена ближче до місця нанесення крові) і контрольна. На тестову смугу попередньо імобілізовано антитіла, специфічні до противірусних антитіл, які можливо є у пацієнта. На контрольній смузі імобілізовано антитіла, специфічні до контрольних антитіл, зв’язування яких дає змогу перевірити, чи тест працює нормально. На специфічну ділянку смужки також наперед нанесено вірусний антиген, вкритий наночастинками колоїдного золота (які в цьому разі виконують роль мітки) і контрольні антитіла, кон’юговані з такими наночастинками. Після нанесення зразка крові на смужку за дії капілярних сил білки мігрують в бік тестової і контрольної смуг. Якщо в зразку наявні антивірусні антитіла, то вони зв’язуються з анти-антитілами на тестовій смузі. Контрольні антитіла зв’язуються з антитілами, специфічними до них, на контрольній смузі. Мітка – колоїде золото, дає змогу візуалізувати утворення комплексів між антитілами. Отже, виявлення 2-х смуг на тест-касеті є позитивним результатом тесту. За відсутності в крові антивірусних антитіл на тест-касеті можна бачити лише одну контрольну смугу (негативний результат тесту).
Чутливість тестів висока – від 92 до 100%, але вони не призначені для використання на ранніх стадіях зараження, оптимальні показники можна отримати через 15 днів після появи симптомів зараження.
Імуноферментний аналіз (ІФА, ELISA)
Цей аналіз може бути якісним і кількісним. У ньому зазвичай використовують зразки цільної крові, плазми або сироватки крові пацієнтів. Використовують планшет, в лунки якого внесено вірусний антиген – білок S SARS-Cov2. Зразки від пацієнтів інкубують з цим білком, і якщо у пацієнта є антитіла до нього, вони зв’язуються між собою. Потім зв’язаний комплекс антитіло-білок можна виявити за допомогою вторинних анти-IgG антитіл, кон’югованих з ферментом, який каталізує реакцію з перетворенням безбарвного субстрату у кольоровий продукт, або продукт, який дає флуоресценцію. Інтенсивність забарвлення або флуоресценції зразка пропорційна кількості утворених комплексів Ig-S, що дає змогу визначити титр антитіл до вірусу. При діагностиці COVID-19 за допомогою цього методу найчастіше тестують пацієнта на антитіла IgG та IgM. Тривалість тесту – 2-5 годин.
Хемілюмінесцентний імуноаналіз
Це кількісний тест. У ньому використовують зразки цільної крові, плазми або сироватки крові пацієнтів. Виконується у подібний спосіб як ІФА, але вторинні антитіла кон’юговані з ферментом, який каталізує хімічну реакцію з виділенням світла. За інтенсивністю люмінісценції можна визначити кількість утворених комплексів між Ig і вірусними білками. Тривалість тесту 1-2 години.
Метод нейтралізації вірусу
Цим методом визначають наявність у сироватці крові пацієнта активних антитіл, які здатні інгібувати розвиток вірусу в культурі клітин людини in vitro. У цих тестах використовують зразки цільної крові, сироватки або плазми крові пацієнта. Метод передбачає використання культур клітин, в яких може розвиватися SARS-CoV-2 (наприклад клітини VeroE6). До зразків розведеної сироватки крові додають суспензії вірусних частинок і наносять на шар культивованих клітин. За кількістю утворених зон лізису (вірусних бляшок) на моношарі клітин визначають, скільки антитіл у сироватці крові пацієнта здатні блокувати реплікацію вірусу. Тривалість тесту – 3-5 діб.
Обираючи той чи інший метод обстеження, насамперед потрібно керуватися рекомендаціями лікаря, оскільки нераціональна діагностика аж ніяк не допоможе у лікуванні.
У медичному центра «Салютас» Ви можете зробити якісну діагностику короновірусу та отримати сучасну консультацію, стосовно ведення пацієнта. Лікарі медичного центру «Салютас» бажають Вам здоров’я, оптимізму та віри у світле майбутнє.